Отчет по изучению иммуномодулирующих свойств препарата Флараксин
Министерство охраны здоровья Украины.
Национальный Медицинский Университет имени А.А. Богомольца
01004, Киев-4, Бульвар Шевченко, 13
тел. (044) 234-60-63
Руководитель исследования:
Зав. Отделом экспериментальной и
клинической иммунологии НИЛУ,
доктор мед. наук, профессор - В.Г.Бордонос
Цель экспериментального изучения
Перспективы широкого использования в онкологической практике с терапевтической целью препарата Флараксин, а также при лечении патологических состояний, сопровождающихся проявлениями вторичного иммунодефицита (воздействие радионуклидов, инфекционных факторов и др.) обусловило необходимость более углубленного изучения иммуномодулирующих свойств флараксина.
В отчете приведены результаты изучения ряда показателей гуморального и клеточного иммунитета у онкологических больных в процессе применения в лечебных целях препарата Флараксин. Были проведены наблюдения у больных со следующими нозологическими формами: рак легких (лечение рака легких, онкология легких) ( РЛ)-10 больных; рак желудка (РЖ)-9; рак молочной железы (лечение рака молочной железы)-(РМЖ)-12; рак сигмовидной кишки и рак прямой кишки (онкология кишечника (РК)-6; рак органов женской половой сферы (РЖПС)-10.
У всех больных опухолевый процесс был определен как III-IV стадия заболевания. В качестве контроля изучены показатели иммунитета в крови 14 доноров крови (практически здоровые люди в возрасте 18-35 лет).
Материалы и методы
Объектом исследования служила кровь больных, из которых были выделены лимфоциты, а также получена сыворотка. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколлурографии (d=1,076 г/см3) и использовали для дальнейшего определения их количественных и функциональных характеристик. Сыворотку крови хранили при t° (- 4 °С) для дальнейшего определения в ней факторов гуморального иммунитета.
Наблюдаемым больным был проведен курс лечения с использованием препарата Флараксин по разработанной в Противоопухолевом Научно-Лечебном Фитоцентре "ФЕНИКС" схеме: внутривенно проводилось 16 инфузий Флараксина с перерывом 7 дней после 8 инфузий (препарат разводился в 20 мл физиологического раствора из расчета 2 мг Флараксина на 1 кг веса больного). Кровь отбирали до начала проведения лечения и через две недели после 16-й инфузии.
Определение количества иммунокомпетентных клеток в крови осуществляли путем постановки реакции розеткообразования с эритроцитами барина в следующих вариантах: общее количество Т-лимфоцитов (Е-РОК) (Jondal I. et al., 1972) ; количество «активных» Т-лимфоцитов (Еакт-РОК) (Wybran, Fudenberg, 1973). количество теофилин чувствительных (супрессорных) и теофилин резистентных (хелперных) Т-лимфоцитов (Limanbul еt. al., 1978). Одновременно осуществляли количественное определение субпопуляций иммунокомпетентных клеток с помощью прямой иммунофлюоресцентной реакции с моноклонильными антителами фирмы «Becton Dickinson» (США): ОКТ–4 - Т-хелперы/индикаторы; ОКТ-8 – Т-супрессоры/киллеры; ОКТ-11 - общий маркер Т-лимфоцитов и ОКТ-22 - общий маркер В-лимфоцитов. Соответственно определяли иммунорегуляторный индекс - СД4/СД8. Результаты исследований приведены в табл.1.
| Группа | E-РOK | Eакт - РOK | Et4-РOK | Etr - РOK | E-0 | ОКТ-11 | ОКТ-4 | ОКТ-8 | ОКТ-22 | CД4/CД8 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Доноры | 60,3±2,1 | 38,9±22 | 45,6±1,2 | 19,1±0,9 | 23,4±1,8 | 57,1±2,1 | 42,9±2,4 | 24,6±1,9 | 27,4±1,2 | 1,8±0,1 |
| Перед лечением | ||||||||||
| РЛ | 38,1±3,4 | 21,7±3,4 | 41,0±2,4 | 13,8±0,6 | 18,2±1,2 | 39,6±2,4 | 33,2±3,1 | 20,5±1,5 | 22,5±2,3 | 1,5±0,7 |
| РЖ | 41,4±2,8 | 18,9±2,1 | 38,9±1,7 | 18,3±1,6 | 21,3±2,7 | 42,8±3,8 | 26,6±2,4 | 21,1±2,8 | 25,6±3,1 | 1,2±0,4 |
| РМЖ | 38,4±1,9 | 22,4±1,6 | 32,4±2,3 | 15,0±2,3 | 24,7±2,3 | 37,4±2,9 | 22,8±3,5 | 19,0±3,1 | 18,1±2,9 | 1,2±0,2 |
| РК | 48,7±4,3 | 19,8±2,0 | 28,1±3,6 | 19,0±1,8 | 19,0±2,0 | 45,5±2,7 | 31,5±2,9 | 22,7±2,6 | 23,0±1,6 | 1,4±0,6 |
| РЖПС | 41,4±3,9 | 18,1±2,5 | 35,0±2,9 | 13,2±1,6 | 18,4±2,9 | 37,8±2,0 | 23,5±4,2 | 17,3±2,0 | 22,4±0,9 | 1,3±0,4 |
| После 1-го курса лечения Флараксином | ||||||||||
| РЛ | 43,8±2,8 | 22,4±2,0 | 42,1±3,1 | 16,7±2,7 | 19,6±1,4 | 42,8±3,4 | 37,9±2,1 | 21,6±1,8 | 23,8±3,2 | 1,8±0,6 |
| РЖ | 46,7±3,1 | 24,8±3,1 | 36,7±2,7 | 18,9±3,1 | 20,5±2,3 | 47,2±2,4 | 25,7±1,2 | 19,8±1,4 | 24,8±2,7 | 1,2±0,9 |
| РМЖ | 42,0±2,5 | 25,6±2,3 | 34,6±1,9 | 17,6±2,0 | 17,1±1,8 | 40,2±1,9 | 21,8±2,8 | 14,7±2,2 | 21,9±1,8 | 1,5±0,7 |
| РК | 52,8±3,4 | 20,4±2,0 | 27,8±2,9 | 17,0±3,7 | 18,1±3,4 | 43,8±2,9 | 29,6±3,2 | 11,9±1,9 | 22,3±2,3 | 2,4±1,2 |
| РЖПС | 43,7±2,1 | 28,3±3,0 | 39,2±3,1 | 16,8±2,2 | 19,5±2,3 | 44,5±1,9 | 22,8±1,9 | 11,6±2,7 | 26,9±1,9 | 2,0±1,6 |
Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.
Анализ представленных в таблице количественных показателей содержания в крови иммунокомпетентных клеток свидетельствует, что у всех исследованных больных имел место выраженный вторичный иммунодефицит. Это проявлялось в снижении содержания Т-лимфоцитов и, в меньшей степени, В-лимфоцитов и их субпопуляциопного состава. Параллельная постановка реакции розеткообразования с учетом чувствительности лимфоцитов к теофиллину и обработка их моноклональными антителами выявила более четкие динамические изменения при применении последней методики. Наиболее выраженное снижение количественных показателей лимфоцитов отмечалось у больных раком легких и раком молочной железы. О наличии иммунодефицита у них свидетельствовали и показатели иммунорегуляторного индекса.
После проведенного курса лечения препаратом Флараксин у всех больных отмечена положительная динамика количественных показателей иммунокомпетентных клеток. Отмечено значительное возрастание количества лимфоцитов - хелперов/индукторов, что нашло свое отражение в повышении иммунорегуляторного индекса.
В группе больных раком кишечника и больных раком органов женской половой сферы иммунорегуляторный индекс превысил этот показатель у доноров. Содержание общей популяции Т-лимфоцитов также статистически достоверно повысилось во всех группах больных. Обращает на себя внимание значительное повышение фракции активных Т-лимфоцитов, что свидетельствует о постепенной нормализации этого важного элемента иммунной системы.
Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали по их митогенному эффекту (РБТЛ) на фитогемагглютинин (ФГА) («Difco» США) радиоизотопным методом с использованием в качестве метки ЗН- тимидин (Adier et al., 1979) с регистрацией результатов на сцинцилляционном счетчике «Inlertechnique IL-4000» ( Франция) и морфологическим методом в модификации Е.Ф. Чернушенко и Л.С. Когосовой (1978) , позволяющем получить информацию о характере и степени трансформации клеток. Показатели бластрансформации лимфоцитов на ФГА у исследованных лиц представлено в табл.2.
| Группа | Спонтанное включение ЗН-тимидина, имп./мин | Стимуляция ФГА имп./мин. | Индекс стимуляции | Морфоло - гический учет, % |
|---|---|---|---|---|
| Доноры | 1385±360 | 92264±7217 | 67,99 | 72,14±2,1 |
| Перед лечением | ||||
| РЛ | 984±235 | 40129±5100 | 40,78 | 42,41±4,7 |
| РЖ | 843±193 | 28524±2414 | 33,83 | 38,10±4,3 |
| РМЖ | 860±211 | 32705±1138 | 38,02 | 41,64±3,9 |
| РК | 722±126 | 22629±1840 | 31,34 | 36,72±4,1 |
| РЖПС | 81±107 | 28666±1732 | 35,34 | 39,40±2,6 |
| После 1- го курса лечения | ||||
| РЛ | 1012±265 | 42504±2315 | 42,05 | 44,06±4,7 |
| РЖ | 890±159 | 31150±1165 | 35,64 | 42,90±4,3 |
| РМЖ | 720±190 | 3528±1632 | 49,25 | 47,64±2,8 |
| РК | 750±175 | 27750±1575 | 37,18 | 42,90±2,6 |
| РЖПС | 790±120 | 32390±1764 | 41,29 | 41,74±5,1 |
Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.
Результаты изучения митогенных изменений Т-лимфоцитов под влиянием стимуляции фитогемаглютинином свидетельствуют, что изначально пониженные функциональные свойства лимфоцитов, наблюдаемые у больных с различной локализацией новообразований, несколько повысились. Это нашло свое отражение в повьшении индекса стимуляциии тенденции к повышению процента бласттрансформации лимфоцитов. Однако, их показатели после 1 курса лечения Флараксином не достигают значений у здоровых лиц, что, по-видимому, требует продолжения курса лечения этим препаратом.
Объективным показателем функционирования В-системы лимфоцитов служит уровень синтеза ими иммуноглобулинов (Ig), в частности, классов IgА, IgМ и IgG. Определение этих показателей проводили в сыворотке крови методом радиальной иммуно-диффузии по Manctnietal. (1965) с использованием моно-специфических анти-сывороток (НИИ вакцин и сыворотоким И.И. Мечникова, Москва). Результаты этих исследований приведены в табл.3
| Группы | Перед лечением | После 1го курса лечения | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Ig A | Ig M | Ig G | Ig A | Ig M | Ig G | |
| Доноры | 2,1±0,24 | 1,61±0,24 | 15,7±1,7 | - | - | - |
| РЛ | 1,98±0,12 | 1,82±0,17 | 16,7±2,2 | 2,10±0,16 | 1,32±0,61 | 14,8±1,4 |
| РЖ | 1,81±0,18 | 1,56±0,12 | 13,4±1,3 | 1,76±0,32 | 1,64±0,28 | 15,1±2,1 |
| РМЖ | 2,14±0,16 | 1,98±0,80 | 18,1±0,9 | 1,90±0,21 | 1,75±0,32 | 16,4±1,7 |
| РК | 2,02±0,14 | 1,63±0,12 | 14,4±1,4 | 1,85±0,30 | 1,50±0,34 | 15,3±2,0 |
| РЖПС | 1,85±0,11 | 1,75±0,80 | 16,7±2,3 | 1,92±0,26 | 1,23±0,21 | 14,8±2,1 |
Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.
Результаты определения иммуноглобулинов сыворотки крови у обследованных больных свидетельствуют, что изменение в их содержании в различных группах были неоднозначными не носили характера определенной закономерности. Так, содержание Ig класса А незначительно отличалось от такового в контрольной группе. После применения препарата Флараксин наблюдалось некоторое IgA снижение, однако, оно не было статистически достоверно. Содержание Ig класса М в случаях рака молочной железы (РМЖ) и рака легких (РЛ) было повышенным, и лишь после 1 курса лечения наметилась тенденция к его снижению. Эта же закономерность прослеживалась и при других локализациях опухоли.
В случаях рака молочной железы (РМЖ) и рака органов женской половой сферы (РЖПС) отмечена тенденция повышения концентрации Ig класса G. После проведенного лечения зарегистрировано снижение содержания Ig класса G до контрольных значений.
Иммунные комплексы (комплекс антиген-антитело) являются важным элементом формирования иммунного ответа. Содержание иммунных комплексов в крови характеризует тяжесть клинического течения болезни, сопровождаемого хроническими воспалительными изменениями и деструктивными процессами. Наблюдения за их динамикой и концентрацией может быть использовано в онкологической практике в диагностике и для прогнозов, а так же для контроля за их эффективностью проводимой терапии.
Определение циркулирующих иммунных комплексов проводили по методу Haskova et at. (1978), используя для их преципитации 3,5% раствор полизтилен-гликоля - м.в. 6000 («Loba Chemie», Австрия) с у четом результатов на микроспектрофотометре «Specol-10» (Германия). Измерения проводили при длине волны 450 nm (ОП450) и выражали результаты в условных единицах экстинкции.
Содержание Циркулирующих Иммунных Комплексов (ЦИК) в крови практически здоровых лиц (доноров) в среднем составляет (М±m) - 49,92±2,85 ед. Концентрация ЦИК в сыворотке обследуемых больных составила: рак желудка (РЖ) - 152±10,4 ед., рак легких (РЛ) - 181,0±8,9 ед., рак молочной железы (РМЖ) - 174,1 ±13,1 ед ; рак кишечника (РК) - 132,05±10,2 ед.; рак органов женской половой сферы (РЖПС) - 139,08±12,1 ед.
После проведения 1 курса лечения препаратом Флараксин (Flaraxin) содержание ЦИК в крови больных составило: рак желудка (РЖ) -201±16,3 ед:; рак легких (РЛ) - 222±14,9 ед:, рак молочной железы (РМЖ) - 189±8,8 ед; рак кишечника (РК) - 156±11,6 ед; рак органов женской половой сферы (РЖПС) - 163±16,5 ед.
Как видно из выше приведенных результатов, во всех наблюдаемых случаях заболеваний с различной локализацией новообразования, имело место значительное повышение содержания ЦИК. Это явление можно объяснить тем фактом, что под влиянием воздействия препарата происходит массивная деструкция опухолевой ткани с дальнейшей резорбцией продуктов распада ретикуло-эндотелиальной системой организма. В результате связывания этих продуктов, имеющих белковую структуру и несущих антигенную информацию, происходит образование соответствующих антител, в свою очередь, образующих дополнительное количество комплексов антиген-антитело (ЦИК).
Пожалуй, наиболее значимыми в изучении состояния иммунной системы у больных злокачественными новообразованиями является определение количественного состава и функциональной активности киллерной (цитотоксической) фракции лимфоцитов крови. Эти лимфоциты являются специализированной популяцией, обладающей цитотоксическим действием к лейкозным, опухолевым и вирус-инфицированным клеткам. В частности, Естественные Киллеры (ЕК), являются «первой линией обороны» против роста опухолевых клеток в организме и осуществляют противоопухолевый надзор, уничтожая появляющиеся в тканях и крови, злокачественно трансформированные клетки. Ослабление активности лимфоцитов-киллеров является одним из определяющих факторов снижения резистентности организма при развитии первичных опухолей. Данные литературы свидетельствуют, что развитие опухолевого процесса сопровождается значительным угнетением киллерного звена иммунологической защиты.
Естественные лимфоциты-киллеры определяли с помощью моноклональных антител NKH-1 («Coulter» США) с использованием прямого иммуно-флюоресцентного метода (А.Л.Пешков и А.И.Полетаева, 1985). Цитотоксическую активность лимфоцитов оценивали в реакциях естественной и антителозависимой цитотоксичности ( С.М.Гордиенко, 1983; Г.Ф.Железнякова и З.У.Гнилевская, 1988). В качестве клеток-мишеней использовали эритроциты кур. Соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней при изучении антителозависимой цитотоксичности составило 25:1, а естественной клеточной цитотоксичности 10:1. Результаты исследований приведены в табл.4.
| Группы | Перед лечением | После 1го курса лечения | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| ЕК % | АЗКЦ % | ЕКЦ % | ЕК % | АЗКЦ % | ЕКЦ % | |
| Доноры | 13,15±1,43 | 22,42±2,59 | 34,11±3,01 | - | - | - |
| РЛ | 9,68±2,14 | 18,12±4,23 | 21,64±2,86 | 10,32±3,30 | 23,84±3,86 | 29,32±2,14 |
| РЖ | 5,03±1,08 | 10,70±2,74 | 19,17±3,72 | 7,48±2,17 | 15,38±2,84 | 23,02±3,07 |
| РМЖ | 6,32±1,24 | 12,32±3,01 | 15,19±2,64 | 6,84±3,14 | 16,43±3,00 | 20,98±2,06 |
| РК | 8,70±1,96 | 17,14±2,72 | 17,32±3,12 | 8,95±2,16 | 19,08±2,83 | 23,74±2,23 |
| РЖПС | 7,28±2,60 | 9,08±2,14 | 14,83±3,74 | 9,81±3,26 | 12,72±3,48 | 24,39±3,09 |
Примечание: Здесь и в последующих таблицах приняли следующие условные обозначения: РЛ - рак легких; РЖ - рак желудка; РМЖ - рак молочной железы, РК - рак кишечника, РЖПС - рак органов женской половой сферы.
Исходя из данных таблицы, можно заключить, что неоплазматический процесс у всех исследуемых больных сопровождается достоверным снижением как количественных, так и функциональных показателей киллерной системы лимфоцитов. Особенно существенным этот дефект отмечен в группе больных раком желудка и раком молочной железы. Проведение первого курса лечения препаратом Флараксин привело к статистически достоверному повышению активности как антителозависимой, так и естественной киллерной активности лимфоцитов.
Однако к сроку наблюдения показатели активности не достигали нормальных значений (контроля). Исключения составляли показатели антителозависимого клеточного цитолиза, а в группе больных раком легкого, где они даже превысили таковые у доноров. Несколько медленнее восстанавливались показатели естественной киллерной активности.
Выявленное положительное влияние препарата Флараксин в терапии больных с новообразованиями на восстановление киллерной активности, а так же количественные показатели лимфоцитов имеют существенное практическое значение.
Проведение онкологическим больным курсов химиотерапии приводит к значительному угнетению функционирования иммунной системы и, в первую очередь, ее цитотоксических факторов. Учитывая, что значительный удельный вес в противоопухолевой защите организма имеет неспецифический иммунный ответ, обусловленный, в основном, ЕК- активностью, восстановление этой функции положительно коррелирует с эффектом химиотерапии.
Важное значение в формировании противоопухолевой резистентности играет взаимосвязь цитологических факторов с системой интерферона. В современной литературе накоплено много фактов о возможной селективной активности ЕК-системы, в частности, влияния интерферона и его индукторов на их активацию при опухолевом росте. Предполагается, что все агенты, усиливающие ЕК-активность, могут действовать через интерферон, который способен модулировать чувствительность клеток-мишеней и усиливать ЕК-активность у животных и человека (Klark Е. et al., 1989; Hanna Н.,1992 и др.). Многими авторами (Herberman R.B. et al., Ortaldo J.R. ,1991; Kadish A.S. et at., 1981 и др.) показано, что обработка ЕК- клеток интерфероном значительно усиливает конъюгацию ЕК- клеток с различными лейкозными и опухолевыми клетками и способствует лизису ЕК- клеток.
Важную роль в усилении цитолитического действия ЕК-клеток отводят индукторам интерферонной активности (Axberg І. еt at., 1990; Herberman R.B.,1982 и др.). Учитывая наличие у препарата Флараксин интерфероногенных свойств ( см. Отчет НИИ Микробиологии и Вирусологии им.Д.К.Заболотного) можно заключить, что его использование в противоопухолевой терапии подтверждает теорию взаимодействия естественных киллеров и клеток – мишеней, что обосновано результатами, приведенных нами исследований.
Выводы
Таким образом, проведенное изучение влияния препарата Флараксин на показатели функционирования различных звеньев иммунной системы у больных с онкологической патологией свидетельствует, что имеющий место системный иммунодефицит, обусловленный опухолевым процессом, подвергается положительной коррекции. Восстановление с помощью этого препарата функционирования ведущих механизмов иммунного процесса сопровождается улучшением общего клинического состояния больных, приводит к снижению, а в ряде случаев и к исключению метастатического процесса, уменьшению размера опухоли.
Руководитель исследования:
Зав. Отделом экспериментальной и
клинической иммунологии НИЛУ,
доктор мед. наук, профессор - В.Г.Бордонос
