Изучение противоопухолевого действия экстракта чистотела.

Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого НАН Украины

Изучение противоопухолевого действия экстракта чистотела было проведено на модели перевивной МХ-рабдомиосаркомы мышей линии ВАLВ/с in vivo (1) и in vitro в системе диффузионных камер (2).

1. Изучение противоопухолевого действия экстракта чистотела in vivo.

Моделью опухолевого роста служила перевивная МХ-рабдомиосаркома (саркома, индуцированная метилхолантреном) мышей линии ВАLВ/с (средняя продолжительность жизни мышей в условиях этой модели 28-32 суток). Опухолевые клетки в количестве 1 млн. клеток в 0,3 мл культуральной среды (состав среды: среда RPMI-1640 (фирма «Sigma») с глютамином, гентамицином и 20% эмбриональной телячей сыворотки (фирма «Sigma») вводили внутримышечно мышам в заднюю лапку. На 7 сутки после перевивки опухоли (появление опухолевого узла) животных распределили на 3 группы, в каждой из которых было по 20 мышей (две опытные и одна контрольная). Мышам опытных групп экстракт чистотела вводили внутрибрюшинно в различных дозах, целесообразность внутрибрюшинного введения обосновывалась как нашими предыдущими исследованиями с использованием иммуномодуляторов, так и данными литературы о том, что локальное введение препарата приводит к выраженному противоопухолевому эффекту [1]. По сколько в условиях настоящей модели введение опухолевых клеток осуществлялось внутримышечно в лапку бедра, то внутрибрюшинное введение представлялось наиболее целесообразным для данной модели. Исследуемую дозу экстракта чистотела рассчитывали, основываясь на данных литературы [2], из расчета 1 г на кг веса. Поскольку средний вес мышей 20 г, то нами были выбраны две дозы – 0,02 г на 1 мышь – доза, полностью соответствующая указанному расчету (1-я опытная группа мышей), и 0,03 г – доза, в полтора раза превышающая предыдущую (2-я опытная группа мышей). Соответствующее количество (дозы) экстракта чистотела разводили физраствором и стерилизовали. Экстракт чистотела мышам вводили в объеме 0,2 мл, каждый из которых содержал либо0,02 г, либо 0,03 г на протяжении последующих 14 дней, начиная с 7 дня после перевивки (появление опухоли). На протяжении всего срока наблюдения ежедневно измеряли объем опухоли (длина и ширина опухолевого узла) и вычисляли вес опухоли по формуле [3]:

Вес (г) = длина Х (ширина)2/ 2.

На протяжении эксперимента изучали особенности динамики роста и максимальную продолжительность жизни мышей в каждой исследуемой группе и контроле.

Результаты исследований.

На 7 сутки после перевивки опухолевых клеток вес опухоли мышей контрольной и опытных групп был одинаков и составлял 0,19+0,1 г.

Начиная с 11 суток после перевивки опухолевых клеток (5-й день введения экстракта чистотела) в росте опухоли мышей группы № 1 по сравнению с контролем регистрируются различия. Так, в группе № 1 вес опухоли был приблизительно в 1,5 раза меньше по сравнению с контролем и составлял 0,23+0,01 г. Вес опухоли мышей в контроле и в опытной группе № 2 (0,03 г экстракта чистотела) был одинаков и составлял 0,32+0,01 г (рис.1).

На 14 сутки после перевивки опухоли (8 день введения экстракта чистотела) наблюдается торможение роста опухоли мышей групп № 1 и № 2, которое проявляется в уменьшении размера опухоли в 1,5 раза по сравнению с контролем (вес опухоли в контроле был 0,78+0,1 г, и одинаковым – 0,43+0,3 г в группах № 1 и № 2).

С 18-х по 21-е сутки (окончание введения экстракта чистотела) сохраняются те же различия в динамике роста опухолей мышей контрольной и опытных групп.

На 23 сутки наблюдается резкое увеличение веса опухоли мышей в группе № 2, однако, несмотря на это, продолжают сохраняться различия в динамике роста опухоли мышей контрольной и опытной группы № 1 (вес опухоли мышей группы № 1 приблизительно в 2 раза меньше, чем у контрольных ) (рис.2).

На 25 сутки наблюдается резкое увеличение опухоли мышей группы № 1, хотя и сохраняются различия в 1,5 раза в весе опухоли по сравнению с контролем (2,8+0,2 г и 4,0+0,18 г, соответственно). В группе мышей № 2 опухоль достигает таких же размеров как в контрольной (3,9+0,1 г).

На 28 сутки после введения опухолевых клеток мышам, наблюдается торможение скорости роста опухоли мышей опытных групп по сравнению с контролем: в группе № 1 вес опухоли составил 3,66+0,3 г, а в группе № 2 – 4,64+0,2 г, в контроле – 7,73+0,3 г.

На 32 сутки после перевивки наблюдается резкое увеличение веса опухоли в контрольной группе и незначительное увеличение веса опухоли в группе № 2. Таким образом вес опухоли мышей группы № 1 был меньше в 2 раза по сравнению с весом опухоли мышей группы № 2 и в 4 раза – по сравнению с контролем (3,58+0,2 г, 6,67+0,2 г, 14,2+0,25 г, соответственно).

На 34 сутки сохраняются те же закономерности динамики роста опухоли мышей контрольных и опытных групп, максимальная продолжительность жизни мышей контрольной группы составила 35 суток (рис.2).

В течение последующей недели в динамике роста опухоли мышей опытных групп существенных изменений не наблюдалось, так как увеличение роста опухоли было незначительным.

На 42 сутки вес опухоли мышей группы № 1 существенно не изменяется по сравнению с предыдущими сроками исследования и составляет 3,65 + 0,25 г. Вес опухоли мышей группы № 2 – 8,18+1,1 г.

Максимальная продолжительность жизни животных группы № 2 была равна 45 суткам, что на 10 суток превышает продолжительность жизни мышей контрольной группы, и составляет увеличение продолжительности жизни мышей этой группы на 28% по сравнению с контролем. В момент гибели животных группы № 2 существенных различий в весе опухоли по сравнению с контрольной группой не наблюдалось.

Максимальная продолжительность жизни животных группы № 1 была равна 55 суткам, что на 20 суток превышает продолжительность жизни мышей контрольной группы, и составляет увеличение продолжительности жизни мышей этой группы на 57,1% по сравнению с контролем. Необходимо подчеркнуть, что в отличие от мышей группы № 2, вес опухоли мышей группы № 1 на момент гибели животных отличался от такового у контрольных мышей (опухоли были в 1,5 раза меньше).

Таким образом, исследование противоопухолевой активности экстракта чистотела в системе in vivo (модель перевивной МХ-рабдомиосаркомы) показало, что введение экстракта чистотела в дозе 0,02 г на мышь (терапевтическая доза) имеет преимущество перед дозой 0,03 г на мышь и оказывает выраженный противоопухолевый эффект, который проявляется в изменении динамики роста (вес опухоли) и достоверном увеличении продолжительности жизни мышей.

2. Изучение противоопухолевого эффекта экстракта чистотела in vitro.

Изучение противоопухолевого эффекта экстракта чистотела in vitro проводили в системе диффузионных камер с использованием опухолевых эксплантатов и изолированных опухолевых клеток при добавлении тех же доз экстракта чистотела, что и в опытах in vivo (0,02 г и 0,03 г).

Получение опухолевых биоптатов: из удаленной опухоли стерильно вырезали фрагменты ткани, лишенные сосудов и очагов некроза, измельчали их ножницами до размера не больше 0,2-0,3 мм.

Получение изолированных опухолевых клеток: из удаленной опухоли стерильно вырезали фрагменты ткани, лишенные сосудов и очагов некроза, измельчали их ножницами до размера не больше 0,2-0,3 мм, и в течении 30-40 мин. при 37ºС в 0,2% культивировали в растворе трипсина в среде RPMI-1640 (Sigma, USA), при постоянном перемешивании на магнитомешалке. Выделенные клетки отмывали трехкратным центрифугированием при 425g в культурной среде и подсчитывали в камере Горяева при суправитальной окраске трипановым синим.

Изучение противоопухолевого действия экстракта чистотела: противоопухолевое действие определяли по способности экстракта чистотела подавлять опухолевый рост и образование сфероидов опухолевыми клетками. Сфероиды – упорядоченные колониеподобные структуры с признаками спиральной ориентации, их можно рассматривать как микромодель опухолевого узла, они также отображают основные характеристики данных опухолей. Противоопухолевое действие изучали в диффузионных камерах: 2-3 биоптата или 1 млн. опухолевых клеток помещали в диффузионные камеры, состоящие из 2 тефлоновых колец, на которые наклеивались с помощью клея ВФ-6 миллипоровые фильтры диаметром 0,23 мк («Сынпор-8», Чехия). Диффузионные камеры помещали в 24 луночные планшеты, в опытные образцы добавляли экстракт чистотела в исследуемых дозах, и культивировали в течении 5 суток в среде RPMI 1640 (Sigma, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, USA), при температуре 37ºС и насыщении воздушной среды 5% СО2. Препараты фиксировали 1 час в спритформоле, окрашивали 20 минут гематоксилином Караччи, проводили через батарею спиртов восходящей концентрации (500, 700, 960, 1000), просветляли в ксилоле. Препараты готовили в капле канадского бальзама на предметном стекле, изучали при помощи микроскопа МБИ-6, об.20, 40, ок.10.

Для дифференцированного учета особенности роста эксплантантов опухолей и изолированных опухолевых клеток была разработана 9-бальная система оценки, которая давала возможность детально характеризовать рост опухолевых клеток в диффузионных камерах и представить данные в графическом изображении:

1. Отсутствие роста.
2. Незначительный рост.
3. Начальный этап опухолевого роста: образование монослоя.
4. Появление монослоя низкой плотности.
5. Образование монослоя средней плотности.
6. Начальные этапы сфероидообразования: конгломераты клеток.
7. Сфероидообразование (1-2 сфероида в поле зрения).
8. Сфероидообразование (3-5 сфероида в поле зрения).
9. Сфероидообразование (10-12 сфероидов в поле зрения).

Система оценки также включала 2 показателя: А-деструкция опухоли, В-монослой низкой плотности.

Микроскопическое изучение фильтров диффузионных камер, на которые были помещены биоптаты опухолей мышей и изолированные опухолевые клетки МХ-рабдомиосаркомы без добавления экстракта чистотела (контроль) показало, что характерной особенностью роста in vitro, в данном случае является образование монослоя низкой плотности и миграция опухолевых клеток (рис.3).

Добавление в среду культивирования экстракта чистотела в дозе 0,02 г приводит к значительному торможению опухолевого роста, что проявляется в отсутствии миграции клеток, в некоторых случая наблюдается деструкция опухолевых клеток (рис.3).

Добавление в среду культивирования экстракта чистотела в дозе 0,03 г также приводит к торможению опухолевого роста и миграции опухолевых клеток, однако деструкции в этом случае не наблюдалось (рис.3).

Сравнительная оценка противоопухолевого эффекта экстракта чистотела в дозе 0,02 г и 0,03 г показала, что и в системе in vitro использование дозы 0,02 г также имеет преимущества по сравнению с дозой 0,03 г в проявлении противоопухолевого действия.

Таким образом, представленные данные по изучению влияния экстракта чистотела in vitro в диффузионных камерах свидетельствует о том, что экстракт чистотела обладает значительным противоопухолевым действием, которое проявляется в деструкции опухолевых клеток при отсутствии какой-либо способности опухолевых клеток к миграции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований противоопухолевого эффекта экстракта чистотела с использованием in vivo (перевивная МХ-рабдомиосаркома) и in vitro (культивирование эксплантатов МХ-рабдомиосаркомы) в диффузионных камерах свидетельствует, что экстракт чистотела обладает противоопухолевой активностью, которая проявляется в изменении динамики роста опухоли, увеличении продолжительности жизни мышей и торможением роста с деструкцией опухолевых клеток в диффузионных камерах.

Полученные результаты дают основание для проведения последующих клинических испытаний с местным применением экстракта чистотела в качестве свечей, мазей и т.д.

Список литературы

1. Бережная Н.М., Горецкий Б.А.. Интерлейкин-2 и злокачественные новообразования. Киев: Наук. думка, 1992 г. 174 стр.
2. Лікарські рослини. Енциклопедичний довідник. За ред. Акад. АН УРСР А.М.Гродзинського. Київ 1989 р.
3. R.C.McKenzi, A.Oran, C.A.Dinarello, D.N.Sauder. IL-1 receptor antagonist inhibits subcutaneous melanoma B 16 growth in vivo // Anticancer Research 1996.-V.16.- №1. Р.437-243.

Авторы

Н.М.Бережная - доктор медицинских наук, профессор, Зав. лаборатории иммунологии и аллергологии Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого НАН Украины.

Контактный адрес

Адреса: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45
Бережная Нинель Михайловна
Тел. 1: (044) 259-01-83,
Тел. 2: (044) 258-16-56